粗提和纯化方法

粗提和纯化方法    

腹水型单抗的纯化

在单克隆抗体的纯化,有必要进行预处理以腹水进一步提取特殊残基和小颗粒细胞和脂肪滴。常用的措施如下:

1、过滤离心

腹水是过滤微孔过滤去除较大的凝块和脂肪滴。细胞碎片和小颗粒物质与10000g 15分钟高速离心(4℃)删除。

2、硅胶吸附

腹水(或冻存的腹水)稀奇古怪,2000r/min 15分钟,去除细胞因子(或冻存过程中形成的固体物质);表面清凉的腹水,相当于pH7.2巴比妥缓冲液(VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/L NaCl,0.8mmol/L Mg2+,0.3mmol/L Ca2+)稀释;然后每稀释10mL 150硅微粉、腹水混合,30分钟,在室温下悬浮液培养反复震荡;2000g离心20分钟。通过去除脂肪的方法,澄清腹水。

3、混合梗直

上面两种方法结合起来,第一个高速离心的上清和腹水,硅胶吸附处理。

两和单克隆抗体

1、硫酸铵的方法

对(1)强硫酸铵溶液的制备

500g硫酸铵加入500mL蒸馏水,加热溶解,室温调节,让它留在沉淀结晶。在服用规定量,用2mol/L氢氧化钠溶液的pH为7.8。

(2)盐析

良好的学习10ml腹水入小烧杯中,在搅拌下,加入饱和硫酸铵溶液5.0ml;继续缓慢搅拌30分钟;10000r/min离心15分钟;弃去上清液,1 / 3饱和度的硫酸铵悬浮泥沙,30分钟的搅拌工具,用重复步骤方法离心前;1-2溶液;在1.5ml PBS(0.01mol/L PH7.2)或Tris-HCl缓冲沉积物。

(3)淡化

常用的柱层析或透析。采用柱层析盐析的例子通过Sephadex G-50柱,用PBS或Tris-HCl慢

解决方案被视为平衡液和洗脱,流速每分钟1ml。第一个蛋白峰脱盐溶液。透析法透析袋2% nahco3,1mmol/L EDTA溶液中煮沸10分钟,冲洗后用蒸馏水透析袋的表面,然后用蒸馏水透析10分钟,冷却至室温可操纵(并可于0.2mol/L EDTA溶液中,4℃保存备用)。盐析样品装入透析袋,50-100体积PBS或Tris-HCl缓冲液透析(4℃)12-24小时,其间5透析液的更换,以萘(碘化汞11.5g,碘化钾8g,加蒸馏水50ml,待溶解后,再加20% NaOH 50ml)检测试剂,直到黄色物质透析液变得那么远。

在(4)蛋白含量的测定

(Pr)(mg/ml)=(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数;或(Pr)= OD280×稀释倍数/ 1.3

(5)冷冻贮藏

2、悲伤的硫酸铵沉淀法

该方法简单适用的IgG1和IgG2b的净化,但IgG3和IgA和净化结果差异的比差。关键步骤如下:1样品预处理2对腹水pH5.0醋酸缓冲溶液、1mol/L HCl调节pH值至4.8;每毫升稀释的腹水加11ul辛酸比,搅拌滴加在加4℃30分钟后酸在室温下静置2小时,取出15000g离心30分钟,弃去上清液沉淀;尼龙筛(125um),加入1/10体积的PBS溶液、1mol/L NaOH调pH至7.2;加入饱和硫酸铵饱和度为45%下4度,30分钟,站了1小时;30分钟,10000g离心上清液;沉淀溶于PBS(含 137mmol/L NaCl,2.6mol/L KCl,0.2mmol/L EDTA)PBS一个适当的量,量的透析的50-100倍,4度过夜,而2Ch改变水的3倍以上;30分钟取出10000g离心,除去不溶物,蛋白质含量的测定,包装,冷冻保存。

3、球蛋白沉淀法

该方法应用于IgG3和IgM抗体捕获

抗体的活性完全保留标准,恢复IgG3高于90%,IgM单克隆抗体回收率为40-90 %的范围内。它负责以下步骤:以预处理后的腹水量要求,加入了NaCl和氯化钙,钠和25mmol/L浓度差异,与纤维蛋白的呈现;通过滤纸,去离子水体积的滤液透析100次,4℃8-15小时(若是IgG3单抗,也可室温2小时),这换水去除22000g后1-2次;30分钟,离心,上清液;沉淀溶解在pH8.0 1mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl溶液,重复上述透析和离心;泥沙优球蛋白溶解浓度5-10mg/ml,包装和冷冻保存。有单克隆抗体的纯化方法很多,有三种方法:DEAE离子交换层析和凝胶过滤。

   


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